Ruolo della proteina MLC1 nella modulazione Ca2+-dipendente della corrente cloro volume-attivata

INDICE

INTRODUZIONE

1. La leucoencefalopatia megalencefalica con cisti subcorticali (MLC)……………3

1.1. La proteina MLC1: caratteristiche biochimiche e localizzazione subcellulare..5

1.2. Espressione di MLC1 ………………………………………………………………8

1.3. La patogenesi della MLC: dai modelli cellulari a quelli animali………………..9

2. I canali del cloro attivati dal volume (VRAC) ………………………………………11

2.2. Proprietà biofisiche e farmacologia del VRAC…………………………………..12

2.3. Modalità di attivazione del VRAC…………………………………………………14

2.4. Natura molecolare del VRAC………………………………………………………15

2.5. Ruolo del VRAC nella regolazione del volume cellulare………………………..16

2.6. Regolazione del volume cellulare negli astrociti………………………………..18

2.7. Ca2+ dipendenza del VRAC………………………………………………………20

2.8. Evidenze sperimentali della regolazione di VRAC da parte MLC1……………21

IPOTESI DI LAVORO……………………………………………………………………22

MATERIALI E METODI…………………………………………………………………23

RISULTATI………………………………………………………………………………..24

DISCUSSIONE…………………………………………………………………………..31

CONCLUSIONI………………………………………………………………………….33

BIBLIOGRAFIA………………………………………………………………………….35

1. La leucoencefalopatia megalencefalica con cisti subcorticali (MLC)

Le leucodistrofie comprendono un elevato e diversificato numero di malattie genetiche rare che colpiscono principalmente il SNC con eziologia diversa.La European Leukodystrophies Association (ELA) offre una classificazione che include i seguenti tipi: perossisomiale, lisosomiale, vacuolata, ipomielinizzante, atipica, indeterminata.

A fronte di una eziopatogenesi così eterogenea, il bersaglio comune di tutte le leucodistrodie è la mielina: “o la mielina non si forma, oppure si degrada o è troppo abbondante”. Le leucodistrofie hanno un'incidenza di 1 su 7.663 nati vivi (Bonkowsky et al., 2010) e si manifestano principalmente durante l'infanzia o l'adolescenza.

La leucoencefalopatia megalencefalica con cisti subcortical (MLC), descritta per la prima volta nel 1995, appartiene al gruppo delle leucodistrofie vacuolata a esordio infantile (Van der Knaap et al., 1995a,b, 1996; Singhal et al., 1996), e’ una rara leucodistrofia spongiforme ereditaria a trasmissione autosomica recessiva che si manifesta alla nascita o entro il primo anno di vita.

Clinicamente, la MLC è caratterizzata da macrocefalia (o megaencefalia),edema cerebrale, cisti subcorticali e vacuolazione sia della mielina che degli astrociti (Estevez et al., 2017), associata a deterioramento delle funzioni motorie con atassia e spasticità, crisi epilettiche e declino mentale; traumi cranici minori o infezioni

comuni possono portare a un peggioramento delle condizioni cliniche spesso con convulsioni, incoscienza prolungata e deterioramento motorio (Van der Knaap et al., 1995a,b, 1996; Singhal et al., 1996; Topcu et al., 1998; Bugiani et al., 2003).

Analisi tramite la risonanza magnetica cerebrale (MRI) mostrano la presenza di unrigonfiamento diffuso della sostanza bianca, cisti sottocorticali (principalmente nelle

regioni temporale e fronto-parietale) e, in alcuni pazienti, grave neurodegenerazione (Mejaski-Bosnjak et al., 1997). L'analisi delle biopsie cerebrali ha inoltre rivelato la presenza di vacuoli liquidi tra le lamelle esterne delle guaine mieliniche, suggerendo difetti nella compattazione delle lamelle o nella loro scissione lungo la linea

intraperiodale (Van der Knaap et al., 1996; Pascual-Castroviejo et al., 2005). Alterazioni funzionali e strutturali (presenza di vacuoli intracellulari e rigonfiamento a livello dei “piedi”, le zone cellulari a contatto con i vasi sanguigni), sono state riportae come caratteristiche istopatologiche della MLC (Van der Knaap et al., 1996; Ló-

pez-Hernández et al., 2011b).

Il primo gene a essere stato identificato come causativo di MLC è stato mappato sul cromosoma 22qtel e nominato MLC1 (Topçu et al., 2000; Leegwater et al., 2001).Il gene MLC1 è costituito da 12 esoni con un primo esone non tradotto, che

copre almeno 24 Kb (Steinke et al., 2003).Un ampio spettro di mutazioni patogene

di MLC1 (incluse mutazioni missenso, siti di splicing, inserzioni e delezioni) è stato identificato in circa l'80% degli individui affetti da MLC (Boor et al., 2006). Le mutazioni sono distribuite lungo l'intera sequenza proteica MLC1 e non mostrano una chiara correlazione con la gravità del fenotipo della malattia (Patrono et al., 2003;

Montagna et al., 2006).

Il gene MLC1 codifica per una proteina principalmente espressa negli astrociti cerebrali, in particolare all'estremità dei piedi degli astrociti a contatto con la barriera emato-encefalica e la membrana piale che costituisce le meningi. Recentemente,

mutazioni in un secondo gene che codifica per la proteina di adesione cellulare GlialCAM, sono state trovate in circa il 50% dei pazienti con MLC non portatori di

mutazioni in MLC1 (<20% della popolazione affetta da MLC; López-Hernández et

al., 2011a). GlialCAM è altamente espresso nel fegato e nel sistema nervoso centrale, in particolare nei neuroni e nelle cellule gliali, dove si lega a MLC1 (LópezHernández et al., 2011b). L'identificazione di GlialCAM come chaperon molecolare e modulatore funzionale del canale del Cl- ClC-2 (Jeworutzki et al., 2014) ha permesso di spiegare le somiglianze tra le alterazioni cerebrali riscontrate nei topi ClC- 2 KO (Blanz et al. ., 2007) e quelle caratteristiche dei pazienti con MLC.

Sebbene GlialCAM sia stato inizialmente identificato come il chaperon molecolare responsabile dell’inserimento in membrana sia MLC1 che ClC-2 negli astrociti, la relazione tra MLC1 e il canale ClC-2 non è ancora completamente compresa. L’elevata espressione di MLC1 negli astrociti e le alterazioni cerebrali osservate nei

pazienti affetti da MLC con mutazioni nel gene MLC1(edema, cisti fluide, astrociti e

vacuolizzazione della mielina), le caratteristiche strutturali di MLC1 e il fatto che

MLC1 stabilisce interazioni strutturali e/o funzionali con diversi canali ionici e con

proteine accessorie dei canali stessi, suggeriscono che MLC1 potrebbe svolgere un

ruolo nella regolazione dei flussi di ioni e acqua e del volume cellulare. Tuttavia, sebbene diversi studi recenti supportino questa ipotesi (Ridder et al., 2011; Lanciotti et al., 2012; Brignone et al., 2014; Hoegg-Beiler et al., 2014; Dubey et al., 2015), l'esatta funzione di MLC1 è ancora sconosciuta.

1.1. La proteina MLC1: caratteristiche biochimiche e localizzazione subcellulare

Dopo la scoperta che le mutazioni nel gene MLC1 rappresentano la causa principale della patologia MLC, diversi gruppi di ricerca hanno cominciato a studiare la funzione fisiologica della proteina MLC1 con l'obiettivo di svelare i meccanismi patogenetici alla base della malattia. L'analisi della sequenza nucleotidica primaria ha

indicato che il gene umano MLC1 codifica per una proteina altamente idrofoba di

377 amminoacidi contenente otto domini transmembrana e corte code carbossiterminali nel versante citoplasmatico (Fig. 1) (Meyer et al., 2001; Teijido et al. , 2004;

ì Lanciotti et al., 2012; Lanciotti et al., 2016). MLC1 è espressa solo da pochi tipi cellulari nell’organismo umano. Un’elevata espressione è riscontrata negli astrociti (Hamilton et al., 2018), le principali cellule gliali del sistema nervoso centrale, fondamentali per la comunicazione neuronale, il supporto trofico e il mantenimento dell’omeostasi cerebrale. Nello specifico, la proteina MLC1 è espressa a livello dei “piedi”, zone specializzate della cellula astrocitaria che sono a contatto stretto con i vasi sanguigni della barriera ematoencefalica e con la membrana piale che costituisce le meningi.

MLC1 contiene anche una struttura di ripetizione interna che determina una parziale omologia della sequenza primaria tra le due metà della proteina che si trova anche in diversi canali ionici (Teijido et al., 2004). Tuttavia, l'analisi della sequenza

aminoacidica indica che MLC1 non ha somiglianze con proteine note, ad eccezione

di un'omologia molto bassa con la subunità Kv1.1α del canale del potassio (K+) legato al canale shaker (meno del 20% di identità aminoacidica; Teijido et al., 2004).

Sulla base di queste conoscenze, i primi studi si sono focalizzati nell’identificazionedelle caratteristiche biochimiche e strutturali della proteina MLC1. Esperimenti condotti su cellule eterologhe trasfettate (cellule HeLa e ovociti di Xenopus; Teijido

et al., 2004), astrociti primari di ratto in coltura e tessuto cerebrale di ratto (Teijido et

al., 2004; Ambrosini et al., 2008) hanno dimostrato che MLC1 è una proteina di 36- 40 kDa in grado di formare strutture dimeriche e oligomeriche altamente stabili (principalmente dimeri ma anche tetrameri). Inoltre, utilizzando tecniche di frazionamento subcellularesu astrociti di ratto e su tessuto cerebrale, si è riscontrato che la forma monomerica MLC1 è presente solo nella frazione citosolica (principalmente frazione degli organelli) mentre i dimeri sono associati ai compartimenti di membrana (membrana plasmatica e membrane del reticolo endoplasmatico; Ambrosini

et al. ., 2008; Lanciotti et al., 2010).

Analisi della sequenza primaria di MLC1 ha rivelato differenti siti potenziali di modifica post-traduzionale, inclusi siti di fosforilazione e glicosilazione (Figura 1). Tuttavia, esperimenti con endoglicosidasi e di mutagenesi sito-diretta del sito di glicosilazione putativo hanno portato alla conclusione che MLC1 non sia glicosilato quando espresso in cellule eterologhe (Teijido et al., 2004), sebbene non si possa escludere che la proteina endogena sia glicosilata negli astrociti. Studi in vitro su

peptidi ricombinanti e proteine endogene di astrociti di ratto indicano che MLC1 è

fosforilata ai suoi terminali amminico (da PKA e PKC) e carbossilico (PKC) (Lanciotti et al., 2010). Inoltre, agonisti della PKC o della PKA e gli inibitori della fosfatasi (forskolina, acido okadaico, esteri del forbolo, genisteina) influenzano l'espressione di MLC1 sulla membrana plasmatica così come la formazione di strutture

multimeriche (Lanciotti et al., 2010).

Figura 1. Rappresentazione schematica della struttura e della sequenza amminoacidica della protein MLC1 umana. L"immagine mostra i motivi consenso per le modificazioni post-traduzionali (glicosilazioni e fosforilazioni), i siti di interazione protein-proteina o protein-lipidi dei segnali di trafficking della protein sia putative (cerchi vuoti) o identificati funzionalmente (cerchi pieni) (modificato da Lanciotti et al., 2012).

È interessante inoltre notare che l'analisi della sequenza amminoacidica MLC1 ha

rivelato la presenza di un motivo di ritenzione ER a base di arginina RXR (Schutze

et al., 1994; Michelsen et al., 2005) localizzato nel terminale amminico vicino ai siti

di fosforilazione PKC e PKA (Figura 1). La fosforilazione dei siti adiacenti al motivo

di ritenzione RXR, puo’ indurre una determinata proteina a interagire con il meccanismo di secrezione a valle, nascondendo od ostacolando i segnali di ritenzione,

consentendo quindi il traffico di canali/recettori verso la membrana plasmatica

(Scott et al., 2003). Dati recenti suggeriscono che l’attivazione della PKC e PKA

promuove l’espressione di MLC sulla membrana plasmatica, nonché il suo corretto

funzionamento. Questa regolazione fosforilazione-dipendente è comune anche a

diversi canali ionici e trasportatori, la cui corretta attività viene espletata sulla membrana plasmatica.

1.2. Espressione di MLC1

Una delle poche certezze sulla proteina MLC1 è la sua espressione predominante

negli astrociti, in particolare negli astrociti terminali a contatto con i vasi sanguigni

cerebrali. La prima evidenza dell'espressione di MLC1 nelle cellule gliali proviene

da uno studio di ibridazione in situ nel cervello di ratto, che dimostra come l'mRNA

di MLC1 sia principalmente espresso in cellule precursori neurali multipotenti durante il periodo pre e perinatale, e negli astrociti, nella glia di Bergmann e nelle cellule ependimali, ma non degli oligodendrociti e nei neuroni (Schmitt et al., 2003).

Inoltre è stato osservato che MLC1 è regolato durante lo sviluppo cerebrale nel

topo, essendo espresso al massimo al quinto giorno dopo la nascita per poi diminuire a un livello più basso e stabile dal giorno 7 dopo la nascita all'età adulta. Più recentemente è stata dimostrata la corrispondenza temporale tra l'espressione di

MLC1 nel cervello umano e di topo (Dubey et al., 2015). Usando anticorpi specifici,

è stato dimostrato che MLC1 localizza prevalentemente nei compartimenti degli

astrociti a contatto con le barriere cerebrali, come i “piedi” degli astrociti che entrano in contatto con i vasi sanguigni, le meningi (membrana piale) e le cellule epen-dimali che rivestono i ventricoli, e nella glia di Bergmann nel cervelletto, mentre non è presente nei neuroni, oligodendrociti, microglia e cellule endoteliali (Teijido et al.,

2004; Boor et al., 2005, 2007; Ambrosini et al., 2008). Al di fuori del sistema nervoso centrale, MLC1 è espresso nelle cellule del sangue, come linfociti, monociti e

macrofagi che si differenziano in vitro (Boor et al., 2006; Petrini et al., 2013). Di

conseguenza, difetti nell'afflusso di Ca2+ indotto dall'iposmosi (vedi sotto) sono stati

registrati nei macrofagi derivati da monociti da pazienti con MLC, sebbene l'impatto

di tali alterazioni sia sconosciuto poiché i pazienti con MLC non mostrano deficit

evidenti nelle funzioni del sangue o del sistema immunitario.

1.3. La patogenesi della MLC: dai modelli cellulari a quelli animali

Per fare luce sulla funzione di MLC1 e sul suo ruolo nella patogenesi delle MLC,

negli ultimi anni sono stati sviluppati diversi modelli patologici sia in vitro che in

vivo. Per gli studi in vitro, la proteina MLC1 normale (WT) o mutata veniva overespressa in cellule eterologhe (HeLa, HEK293 e oociti di Xenopus) o in astrociti.

Studi effettuati su cellule eterologhe che esprimono la proteina mutata hanno dimostrato che diverse mutazioni patologiche missenso compromettevano la corretta traslocazione di MLC1 sulla membrana plasmatica.

Inoltre, le mutazioni patologiche su MLC1 causavano un aumento della sua degradazione, diminuendo l’emivita della proteina (Teijido et al., 2004; Duarri et al., 2008). Questo effetto è stato principalmente attribuito a problemi di misfolding delle proteine e all'attivazione della via di degradazione associata al reticolo endoplasmatico (ERAD) poiché gli inibitori di ERAD erano in grado di bloccare la degradazione di MLC1. Dopo la scoperta che gli astrociti in coltura esprimono livelli alti della proteina MLC1 (Ambrosini et al., 2008), queste cellule sono diventate il modello

in vitro più rilevante per studiare la fisiopatologia di MLC1.

Tuttavia, poiché alcune mutazioni patologiche di MLC1 hanno un comportamento

differente quando espresse negli astrociti di ratto, rispetto a quando sono espresse

in cellule eterologhe (Duarri et al., 2008), si è ritenuto necessario indagare i fenotipi

patologici indotti dalle mutazioni di MLC1, utilizzando una linea cellulare background di astrociti, che non esprimesse la proteina MLC1. A tale scopo, sono state utilizzate cellule di astrocitoma U251, che esprimono livelli quasi non rilevabili di MLC1 endogena. Queste cellule sono state ingegnerizzate in modo da overesprimere stabilmente o la proteina MLC1 normale (WT) o MLC1 contenenti una delle mutazioni missenso trovate nei pazienti con MLC1 (Brignone et al., 2011). Dato che i livelli di espressione di MLC1 nelle cellule U251 ingegnerizzate erano paragonabili

a quelli endogeni degli astrociti di ratto, hanno reso questa linea cellulare un buon

modello per lo studio dei meccanismi molecolari alla base della MLC.

Utilizzando questo sistema in vitro, è stato scoperto che le mutazioni missenso determinavano: i) ritenzione della proteina MLC1 nella membrana del reticolo endoplasmatico con forte riduzione della sua inserzione nella membrana plasmatica; ii)

alterazione delle interazione di MLC1 con differenti proteine precedentemente identificate come interattori della stessa MLC1 come: GlialCAM, Kir4.1, Na, K-ATPase, V-ATPase e canale TRPV4 (Brignone et al., 2011; Lanciotti et al., 2012), suggerendo il possibile coinvolgimento funzionale di MLC1 in questo complesso macromolecolare. È interessante notare che la downregolazione di MLC1 negli astrociti primari di ratto utilizzando l’interferenza a RNA (siRNA), induceva la vacuolizzazione degli astrociti, una caratteristica patologica riscontrata nel cervello affetto da MLC (Duarri et al., 2011) e nei topi mlc1-null (Dubey et al., 2015). Nel loro insieme, questi risultati indicano che la modellazione in vitro della malattia MLC può, almeno in parte, ricapitolare la disfunzione MLC1.

Recentemente sono stati sviluppati due differenti modelli murini in cui il gene MLC1

è stato rimosso (Hoegg-Beiler et al., 2014; Dubey et al., 2015). I topi MLC1-null

presentano alcune caratteristiche della malattia MLC umana, come la megalencefalia a esordio precoce e l'aumento del contenuto di acqua cerebrale, con la comparsa di processi astrocitici aberranti adiacenti alle barriere fluido/cervello e vacuolizzazione progressiva della sostanza bianca. Tuttavia, nessuno dei topi KO sviluppa

disabilità motorie (anche nelle fasi successive della vita) o cisti cerebrali che sono

caratteristiche della malattia umana. L'analisi dei topi mlc1-null ha rivelato che, contrariamente a quanto riscontrato in vitro (López-Hernández et al., 2011b), MLC1 è importante per la corretta localizzazione di GlialCAM e ClC-2 negli astrociti.Prove a sostegno dell'importanza di MLC1 per la corretta localizzazione di GlialCAM e ClC-

2 sono state ottenute anche in colture di astrociti derivati da topi mlc1-null che sono

stati esposti a un'elevata concentrazione extracellulare di K+ che mima l'attività

neuronale (Hoegg-Beiler et al., 2014; Sirisi et al., 2014).

Sebbene i modelli animali KO non siano in grado di ricapitolare completamente la

malattia umana, confermano che i difetti mediati dagli astrociti nei flussi d'acqua e

nella regolazione del volume cellulare sono coinvolti nella patogenesi della malattia

MLC, come suggerito dai risultati nei modelli in vitro. Nel complesso questi risultati

indicano che i modelli sperimentali utilizzati per studiare la funzione MLC1 e la patogenesi della malattia MLC possono fornire risultati diversi (a volte contraddittori).

Alcune discrepanze possono riflettere l'incapacità dei sistemi in vitro di riprodurre la

complessità delle connessioni funzionali e strutturali degli astrociti in vivo. È generalmente accettato che l'inattivazione genica in vivo rappresenti un approccio essenziale per studiare i ruoli fisiologici di diverse proteine. Tuttavia, i topi KO, sebbene utili per una caratterizzazione approssimativa della funzione genica, presentano

alcuni svantaggi per decifrare con precisione i meccanismi patogenetici, tra cui la

ridondanza genica e problemi di sviluppo. Inoltre, non tutte le mutazioni MLC1 analizzate in vitro portano alla completa degradazione delle proteine, un fenotipo ricapitolato dai modelli murini KO. È importante sottolineare che gli astrociti mostrano caratteristiche eterogenee a seconda della specie di origine, della regione del cervello, dello stadio di sviluppo, dei fattori ambientali e degli stati patologici, tutti fattori che possono rendere i risultati sperimentali altamente variabili. La complessità della

glia stessa e il marcato aumento del rapporto tra glia e neuroni nei mammiferi superiori (Pfrieger, 2009) suggeriscono che alcuni ruoli della glia studiati nei modelli murini potrebbero essere non conservati o addirittura più critici nei primati e nell'uomo (Molofsky et al., 2012). Quindi, per le ragioni suddette, è necessario tenere in considerazione vantaggi e svantaggi di ogni sistema sperimentale, per una corretta valutazione dei risultati ottenuti.

2. I canali del cloro attivati dal volume (VRAC)

I canali del cloro (Cl-) hanno classicamente rappresentato una classe di canali ionici

poco studiata. Infatti, a differenza dei canali i canali del sodio (Na+) e del potassio

(K+), che sono stati da sempre riconosciuti come determinanti per processi critici

come la generazione del potenziale d'azione e l'eccitabilità cellulare in generale, e i

canali del calcio (Ca2+), considerati fondamentali nel rilascio sinaptico e nella contrazione muscolare, per lungo tempo ai canali Cl- non è stato assegnato alcun ruolo specifico nei principali processi biologici. Tuttavia, negli ultimi trent’anni circa, diverse famiglie di canali Cl- sono state identificate e sono note oggi per essere alla

base di una vasta gamma di funzioni biologiche, tra cui la secrezione di fluido epiteliale, la regolazione del volume cellulare, il controllo del pH del citoplasma e gli organelli cellulari, la migrazione cellulare. Principalmente in base al tipo di stimolo che li attiva, insieme alle proprietà biofisiche e farmacologiche come dipendenza

dal voltaggio, sequenza di permeabilità, conduttanza a canale singolo e sensibilità

alle tossine o ai modulatori sintetici [24], i canali Cl- sono stati raggruppati in cinque

famiglie principali: (i) recettori per i canali del Cl- dipendenti da neurotrasmettitori

(GABAAR e GlyR); (ii) canali Cl- voltaggio-dipendenti (famiglia ClC); (iii) regolatore

di conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR); canale Cl- attivato da

cAMP-PKA; (iv) canali Cl- attivati dal Ca2+ (CaCC); (v) canali anionici regolati dal

volume (VRAC).

In questo lavoro di tesi, ci concentreremo sullo studio dei canali VRAC. Questi canali sono espressi praticamente in tutte le cellule e sono fondamentali nella regolazione del volume cellulare alla base di numerosi processi cellulari tra cui proliferazione e migrazione. Inoltre questi canali giocano un ruolo importante anche nella

regolazione dei fluidi corporei (Alexander A. Mongin 2016).

2.2. Proprietà biofisiche e farmacologia del VRAC

Da un punto di vista sperimentale, i canali VRAC sono tipicamente attivati dal rigonfiamento cellulare o “swelling”, come conseguenza dell’esposizione della cellula a una soluzione ipotonica extracellulare. La corrente derivante, classicamente definita come corrente Cl- attivata dallo swelling (ICl,swell), mostra specifiche caratteristiche

biofisiche e cinetiche come debole rettificazione esterna (maggiore conduttanza a

potenziali positivi, 50-80 pS, rispetto a quella per potenziali negativi, 10-20 pS) e

un’inattivazione variabile tempo e voltaggio dipendente la cui velocità è strettamente correlata al pH, al Mg2+ extracellulare e al Cl- (Figure 2). Queste caratteristiche

sono, tuttavia, molto variabili tra i tipi di cellule.

Figure 2 - Biophysical properties of VRAC. (a) Time course of the activation and deactivation of

currents through VRAC from mouse aorta endothelial cell (measured at +80 and -80 mV). The solid bar marks the application of a 25% hypotonic solution (HTS, upper panel). Current-voltage (I-V)

curves (lower panel) obtained at the time points indicated. (b) Time-dependent current-voltage relationship. The upper panel shows current traces under isotonic conditions (background current)

taken at the time indicated by I in (a). The lower panel shows current traces during a hypotonic

challenge (II). Traces are from a step-voltage protocol (holding potential is 0 mV, 2 s steps ranging

from -80 to +100 mV, spaced 20 mV). Note the inactivation at positive potentials. (c) Single-channel currents from an outside-out patch obtained after activation of VRAC (lower panel, left) and

from the same voltage protocol. (d) Amplitude histograms from single-channel openings after cell

swelling (outside-out patch pulled from swollen cell which was held at -80 mV and stepped to

+120 mV). The histogram was fitted by four Gaussian functions. Single-channel amplitude was 5.0

pA.

Uno dei principali problemi nello studio del VRAC e nella identificazione della sua

natura molecolare è la mancanza di bloccanti selettivi. Esistono diversi agenti non

specifici che in qualche modo discriminano tra i canali Cl, come DIDS (acido 4,4’–

d i i sot io c iano-2,2 ’- st i lbened i so lfon i co) NPPB (a c ido 5-n itro-2-(3-

fenilpropilammino)benzoico), DCPIB (4 -(acido 2-butil-6,7-dicloro-2-ciclopentilindan-

1-on-5-il)ossibutirrico), tamoxifene, acido niflumico, che a concentrazioni micromolari inibiscono il VRAC (Alexander A. Mongin 2016).Tra questi, l’antagonista che si è dimostrato essere più selettivo e specifico e, ad oggi, inibitore ampiamente utilizzato di VRAC è il DCPIB (Decher, Lang et al., 2001). Recentemente è stata riportata la struttura crio-EM 3D del VRAC legato e bloccato dal DCPIB. Questi dati dimostrano che il DCPIB blocca VRAC occludendola bocca esterna del canale. L'interazione tra il bloccante e il canale avviene elettrostaticamente, con il gruppo acido

carbossilico di DCPIB che interagisce con l'arginina in posizione 103 (R103).

2.3. Modalità di attivazione del VRAC

Generalmente VRAC e’attivato dallo swelling cellulare, ottenuto sperimentalmente

perfondendo le cellule con una soluzione ipotonica extracellulare. Tuttavia, il gruppo di Nilius e altri hanno dimostrato che il rigonfiamento cellulare (ovvero lo stress meccanico applicato sulla membrana plasmatica) non rappresenta di per sé lo stimolo che attiva il canale. Ad attivare il canale è piuttosto una diminuzione della forza ionica intracellulare (Sabirov et al 199, Pedersen et al., 2016). Molti studi riportano il coinvolgimento di varie vie di trasduzione nell’attivazione del VRAC, che richiedono ATP intracellulare, livelli di soglia citoplasmatici di Ca2+ (secondari alla

stimolazione dei recettori purinergici o bradichinina), aumento delle specie reattive

dell'ossigeno (ROS), attivazione di Rho dipendente dalla proteina G e Vie ERK, cascate di fosforilazione o stato di polimerizzazione specifico dei filamenti di actina.

Nel nostro laboratorio, per esempio, abbiamo riportato che nelle cellule di glioblastoma multiforme umano (GBM), esiste una peculiare via di trasduzione alla base dell’attivazione della ICl,swell mediata da VRAC, mai riportata nelle cellule non-tumorali (Catacuzzeno et al., 2014). Nello specifico, abbiamo visto che la ICl,swell attivata

in seguito a swelling cellulare indotto da stimolo ipotonico richiede l’attivazione della

fosfolipasi C (PLC) che promuove la formazione di dicilglicerolo (DAG) il quale a

sua volta viene convertito ad acido fosfatidico che promuove l’attivazione di proteine (Rac1) responsabili della polimerizzazione del citoscheletro di actina (Catacuzzeno et al., 2014). Il blocco selettivo di ciascuno di questi step della via di trasduzione descritta, determina il blocco o una forte riduzione della ICl,swell. Interessante

notare che, come riportato in questo studio, la diminuzione del Ca2+ intracellulare

attraverso l’utilizzo di chelanti come il BAPTA, non influisce sull’ampiezza della

ICl,swell, dimostrando che la corrente trasportata da VRAC è insensibile alla modulazione da parte del Ca2+ citoplasmatico. Tuttavia, questo punto è ancora fortemente

dibattuto in letteratura a causa di dati contrastanti riportati da diversi gruppi di ricerca che dimostrano come, la ICl,swell mediata da VRAC possa essere o meno modulata dal Ca2+.

2.4. Natura molecolare del VRAC

Nel 2014, trent'anni dopo i suoi primi rapporti funzionali e una lunga storia di candidati che risultarono dei falsi positivi (Pedersen et al., 2015), due studi indipendenti

hanno identificato simultaneamente gli otto eteromeri ripetuti ricchi di leucina

(LRRC8A-E) come componenti essenziali del VRAC (Qiu et al., 2014; Voss et al.,

2014). È stato scoperto che il VRAC, per essere funzionale, richiede che venga obbligatoriamente espressa la subunità LRRC8A (dato che il suo knockdown o delezione abolisce la ICl,swell e nessuno degli altri membri della famiglia può sostituirlo) e almeno un'isoforma aggiuntiva LRRC8B-E (Voss et al., 2014).Tutte le isoforme

LRRC8A-E sono costituite da quattro segmenti transmembrana e un dominio di ripetizione ricco di leucina contenente fino a 17 ripetizioni nel segmento C-terminale.

Si pensa che i VRAC funzionali siano organizzati in una struttura esamerica, simile

al pannexina famiglia di canali ionici con cui LRRC8A-E condivide un'elevata omologia (Abascal et al., 2012) (Figura 2). Le molte possibili combinazioni di eteromeri LRRC8 per la formazione del canale possono spiegare le diverse proprietà dei

VRAC, come la permeabilità agli ioni e ai composti organici, il grado di inattivazione

tempo e voltaggio dipendente, la conduttanza di singolo canale e la sensibilità ai

bloccanti riportate da studi elettrofisiologici e farmacologici negli anni. Nessun ruolo

specifico potrebbe essere assegnato in modo conclusivo a nessuno di essi, ad eccezione di LRRC8D ritenuto critico per l'assorbimento di cisplatino e carboplatino all'interno della cellula, e molto probabilmente coinvolto nella resistenza ai farmaci.

Tuttavia, le principali questioni riguardanti la funzione del VRAC sono state sollevate subito dopo l'identificazione delle controparti molecolari del canale stesso, nel

momento in cui è stato dimostrato che: i) diverse linee cellulari erano in grado sopravvivere e proliferare in assenza di tutte e cinque le isoforme LRRC8A-E (Voss et al., 2014; Abascal et al., 2012; Wang et al., 2017); ii) l'isoforma LRRC8A non era necessaria per generare ICl,swell (Milenkovic et al., 2015; Sirianant et al., 2016).

Queste osservazioni hanno sollevato questioni riguardanti non solo le isoforme essenziali/non essenziali per rendere funzionale il VRAC ma mettono anche in discussione più direttamente il ruolo cruciale assunto del VRAC nelle diverse funzioni cellulari fondamentali, tra cui la regolazione del volume cellulare, la proliferazione,

la migrazione, l'apoptosi, suggerendo implicitamente la presenza di meccanismi VRAC-indipendenti ridondanti in grado di sostenere la regolazione del volume o la migrazione cellulare. Resta comunque aperta la questione se il VRAC espresso in

cellule specifiche possa avere altre controparti molecolari non ancora identificate.

Figura 3. Struttura/architettura delle sub unità LRRC8 e del canale ionico VRAC. (a) Rappresentazione schematica della topologia transmembrana delle subunità LRRC8 che mostra i quattro

domini transmenbrana (TM1-4) ed un dominio C-terminale citoplasmatico contenente fino a 17 ripetizioni ricche di leucina. Le subunità LRRC8 presentano mediamente multipli siti di fosforilazione

(indicati nella figura dai pallini in verde) e diversi siti di glicosilazione (non indicati).(b) Struttura

esamerica del canale VRAC, basata sualla sua parziale omologia con i canali pannexin/connexin.

2.5. Ruolo del VRAC nella regolazione del volume cellulare

L'attivazione del canale VRAC da parte dello swelling cellulare suggerisce che il

suo ruolo fisiologico primario sia associato al controllo del volume cellulare. I canali

VRAC (e la corrente ICl,swell che essi mediano) sono espressi ubiquitariamente nelle

cellule di mammifero e la loro attivazione è indotta sperimentalmente dallo swelling

cellulare, risultante dall'esposizione delle cellule a una soluzione ipotonica esterna,

così come dall’aumento della forza ionica citoplasmatica (per esempio in seguito a

dialisi di una soluzione ipertonica durante esperimenti di patch clamp). In risposta

all’aumento del volume cellulare, le cellule avviano un complesso processo omeostatico che consiste principalmente nell'attivazione di VRAC insieme alle conduttanze K+, con conseguente efflusso netto di ioni Cl- e K+. Questo è seguito dallaperdita di acqua osmotica e dal ripristino del volume cellulare originale, un processo noto come regolazione del volume in decremento (RVD). Quindi, è ad oggi ampiamente riconosciuto che la ICl,swell mediata dal VRAC gioca un ruolo preminente

nella mediazione del flusso di ioni Cl- alla base del processo di RVD (Sardini et al.,

2003; Hoffmann et al., 2015, Sforna et al., 2017; Morishita et al., 2019).Come previsto, il blocco del VRAC, come l’utilizzo del DCPIB, compromette il processo RVD

e il ripristino del volume fisiologico della cellula (Sforna et la., 2017).

È noto che attività cellulari chiave come la proliferazione, la migrazione e la morte

cellulare programmata (apoptosi) richiedono cambiamenti significativi nel volume

cellulare e sono quindi sensibili a quei processi alla base della regolazione del volume cellulare. Ad esempio la proliferazione cellulare è stimolata dal rigonfiamento

cellulare e inibita dal restringimento cellulare (Lang et al., 2006; Anbari and Schultz,

1993; Dubois and Rouzaire-Dubois, 2004;Rouzaire-Dubois et al., 2005), mentre

l’apoptosi è associata ad un significativo restringimento del volume cellulare (Maeno et al., 2000). Il processo migratorio è invece associato a cambiamenti ciclici nel

volume cellulare che portano ad avanzamenti cellulari anteriori e retrazioni cellulari

posteriori (Schwab and Stock, 2014). Non sorprende quindi che VRAC e la ICl,swell

ad esso associata, siano di fondamentale importanza in tutti quei processi cellulari

che comportano un cambiamento di volume e forma delle cellule, come la proliferazione, la migrazione e l’apoptosi (oltre a quei processi e funzioni dipendenti dal trasporto dell'osmolita attraverso la membrana, come il settaggio del potenziale di riposo o del pH intracellulare). Nel GBM, ad esempio, è stato suggerito che ICl,swell

mediata da VRAC faciliti l'infiltrazione delle cellule tumorali attraverso i ristretti spazi

del parenchima cerebrale, dove sono richiesti importanti cambiamenti di volume e

forma delle cellule (Cuddapah and Sontheimer, 2011;Lui et al., 2010; Habela et al.,

2009; Ransom et al., 2001; Soroceanu et al., 1999; Tysnes, 2001; Catacuzzeno et

al., 2011)

Figura 4. Regolazione del volume cellulare in decremento (RVD). Rappresentazione schematica mostrante i meccanismi e le proteine principali sottostanti al processo di RVD. A sinistra viene

mostrata una cellula in condizioni stazionarie, in cui la permeabilità della membrana è dominata

dai canali del K+ costitutivamente aperti (canali “leaky”). Destra: nel momento in cui la cellula è sottoposta ad uno shock iposmotico (es. perfusione di una soluzione extracellulare ipotonica), la cellula va in contro ad un rigonfiamento (swelling) con aumento del suo volume causato da un netto

influsso di acqua. Lo swelling rappresenta lo stimolo per l’apertura dei canalai VRAC che mediano

un efflusso di ioni Cl- e di altri osmoliti. L’efflusso di Cl-, insieme a quello del K+ mediato dai canali

leaky (o da altri canali del potassio che rispondono allo stimolo ipotonico), determina una perdita

netta dalla cellula di KCl. La perdita di KCl dalla cellula può essere ulteriormente aiutata da alcuni

cotrasportatori K+ e Cl- (KCC) La conseguente diminuzione di osmolarità nel citoplasma della cellula (che rende l’ambiente intracellulare ipotonico rispetto all’ambiente esterno) promuove la perdita

di acqua seguita da un recupero del volume cellulare ai valori originari. Questo complesso meccanismo di regolazione attiva del volume in risposta allo shock iposmotico prende il nome di regolazione del volume in decremento (RVD).

2.6. Regolazione del volume cellulare negli astrociti

La capacità delle cellule cerebrali di regolare il proprio volume è una funzione

omeostatica essenziale. La composizione ionica e molecolare dell'ambiente extracellulare o intracellulare cambia costantemente durante e dopo l'attività neuronale.

Di conseguenza, i flussi d'acqua per osmosi modificano continuamente il volume

delle cellule. È accertato che gli astrociti sono le cellule principalmente coinvolte

nella regolazione del volume omeostatico nel cervello (Simard and Nedergaard,

2004; Somjen, 2002). La caratteristica forma a stella degli astrociti, con molteplici

processi a contatto con sinapsi e vasi sanguigni, consente loro di regolare finemente la composizione del compartimento interstiziale e di mantenere l'omeostasi idrosalina del sistema nervoso centrale. Per svolgere questo compito, gli astrociti sono dotati di una varietà di canali che trasportano ioni, osmoliti organici e acqua attraverso la membrana plasmatica (Pasantes-Morales et al., 2006). Il flusso d'acqua è

mediato per via osmotica, principalmente attraverso il canale dell'acquaporina-4

(AQP4) (Amiry-Moghaddam and Ottersen, 2003; Pasantes-Morales and Cruz-Rangel, 2010). Tra i canali ionici, è stato dimostrato che l'attivazione del VRAC è fondamentale per l’ RVD (Mongin, 2016; Hoffman net al., 2009; Nilius et al., 1997; Okada, 1997; Lang et al., 1998). Dalla scoperta che LRRC8A è un costituente molecolare essenziale di VRAC, diversi studi hanno riportato una correlazione tra

l'espressione di LRRC8A e la funzione di VRAC in diversi tipi di cellule (46-50). Negli astrociti, il gruppo di Mongin (Hyzinski-García, MC et al., 2014) è stato il primo a

riportare l'espressione dell'mRNA di LRRC8A in astrociti primari di ratto utilizzando

la PCR in tempo reale, dimostrando il ruolo essenziale di LRRC8A/VRAC nel mediare il rilascio attivato dal rigonfiamento di taurina e aspartato. Tuttavia, mancano

ancora prove elettrofisiologiche che LRRC8A media le correnti VRAC negli astrociti,

così come la prova del suo coinvolgimento nella RVD, poiché esprimono altri canali

del cloro, come le bestrofine, anch'esse coinvolte nelle correnti del Cl- dipendenti

dal volume (Kunzelmann, 2015)

In un recente lavoro è stato riportato che la proteina LRRC8A è espressa nella

membrana corticale degli astrociti di ratto in vitro e nel cervello di topo, dove è particolarmente abbondante nei processi astrocitari rivolti verso i vasi sanguigni.Inoltre,

usando l’interferenza dell'RNA, è stato anche dimostrato che, negli astrociti LRRC8A è fondamentale sia per la corrente VRAC che per l’RVD indotto da ipotonicità.

È interessante notare che la localizzazione di LRRC8A nella membrana corticale

degli astrociti è simile a quella della proteina MLC1, suggerendo che queste due

proteine possono interagire e giocare un ruolo critico per la regolazione del volume

cellulare negli astrociti.

2.7. Ca2+ dipendenza del VRAC

Il contributo del Ca2+ intracellulare nella regolazione della ICl,swell mediata da VRAC

è stato dibattuto sin dalla loro prima scoperta alla fine degli anni '80. È stato generalmente ipotizzato che il VRAC sia attivato da una diminuzione della forza ionica

intracellulare, a seguito dell'esposizione a stress ipo-osmotico, un processo in cui i

cambiamenti del Ca2+ intracellulare non hanno un ruolo significativo (Cannon et al.,

1998; Sabirov et al., 2000). È stato infatti riscontrato che l'attivazione del VRAC da parte del rigonfiamento cellulare avviene in presenza di chelanti del Ca2+ intracellulari (cioè EGTA o BAPTA), o in assenza di aumento del Ca2+ citosolico (Okada,

1997; Hoffmann et al., 2009; Akita e Okada, 2014; Catacuzzeno et al., 2014), dimostrando una totale indipendenza del canale VRAC dal Ca2+ intracellulare. Tuttavia, in altri studi eseguiti su differenti tipi cellulari, è stato osservato che il Ca2+ citosolico è in grado di modulare positivamente l’attività del VRAC. Inoltre, un numero

crescente di evidenze hanno anche dimostrato che variazioni del Ca2+ intracellulare

sono importanti nella regolazione dell’RVD, un processo che, come ampiamente

riconosciuto, è sotto lo stretto controllo della ICl,swell mediata da VRAC (Lemonnier et

al., 2002a,b; Akita et al., 2011; Benedetto et al., 2016; Liu et al., 2019), sebbene i

meccanismi molecolari sottostanti sono ancora sconosciuti. Negli ultimi anni sono

stati dissezionati con maggior precisione i meccanismi responsabili della variazione

del Ca2+ citosolico responsabile della modulazione del VRAC. In particolare, alcuni

studi mostrano che l’ingresso localizzato di Ca2+ dall’ambiente extracellulare è in

grado di modulare l’attività della ICl,swell mediata da VRAC, sebbene solo in seguito

alla sua attivazione da parte dello stimolo ipotonico (Liu et al., 2019; Centeio et al.,

2020). In aggiunta, è stato anche dimostrato che, affinché la corrente possa essere

modulata, è necessario un rilascio di Ca2+ da parte degli store intracellulari (es. reticolo endoplasmatico). Sebbene questi risultati indichino chiaramente un ruolo del

Ca2+ nella modulazione del canale VRAC, restano ancora sconosciuti i meccanismi

molecolari che mediano questa modulazione.

Il Ca2+ intracellulare può regolare l'attività dei canali LRRC8/VRAC sia indirettamente, tramite l'attivazione della via PLC/PKC, sia direttamente attraverso una sua interazione con il canale. Il modo in cui il Ca2+ può modulare i canali LRRC8/VRAC varia tra i tipi di cellule.

È dunque possibile che il canale VRAC sia Ca2+ insensibile di per sé, ma altre proteine Ca2+-attivate potrebbero giocare un ruolo importante nella regolazione e nel

potenziamento del VRAC.

2.8. Evidenze sperimentali della regolazione di VRAC da parte MLC1

Studi recenti hanno dimostrato che MLC1 è implicata nella regolazione del volume

cellulare negli astrociti, sebbene la modalità molecolare attraverso cui MLC1 agisca resta ampiamente sconosciuto. Tuttavia, è stato riportato che l"espressione di

MLC1 correla positivamente con l’attività della ICl,swell mediata da VRAC (Elorza-Vidal et al., 2018), indicando che MLC1 è buon candidato per la modulazione di

VRAC. In questo caso MLC1 potrebbe essere l’agente in grado di conferire Ca2+-

sensibilità indiretta al canale VRAC. Questa ipotesi è avvalorata da differenti evidenze riportate in letteratura. Per prima cosa, le variazioni dei livelli del Ca2+ citosolico partecipano nella regolazione dell’RVD. In secondo luogo, è stato dimostrato che il canale cationico TRPV4, che colocalizza con l’AQP4 nell’estremità dei piedi

degli astrociti, dove sono presenti anche MLC1 e LRRC8A, media l’influsso di Ca2+

dall’ambiente extracellulare responsabile dell’aumento dell’RVD negli astrociti in

seguito a swelling indotto da ipotonicità. Terzo, l’overespressione di MLC1 correla

con un aumento dell’attività del TRPV4. Questo fatto suggerirebbe che MLC1, localizzata sulla membrana plasmatica, coopera funzionalmente con il canaleTRPV4 in

modo da regolare l’ingresso di Ca2+ e, di conseguenza, il canale VRAC e l’RVD in

seguito a shock iposmotico.

Sebbene il meccanismo di regolazione di VRAC da parte di MLC1 rimane del tutto

sconosciuto, i dati riportati nella letteratura indicano che: i) MLC1 è coinvolta nella

regolazione del volume cellulare negli astrociti in seguito a swelling cellulare indotto

da shock iposmotico (es. RVD), responsabile della fisiopatologia della MLC; ii)

MLC1 potenzia l"attività della ICl,swell mediata da VRAC, possibilmente regolando direttamente o indirettamente il canale VRAC, conferendogli sensibilità al Ca2+; iii)

MLC1 esprime dei siti di fosforilazione specifici per la chinasi attivata dal complesso

Ca2+-calmodulina (CaM) di tipo II (CaMKII).

Riguardo a quest’ultimo punto, è stato riportato un sito di fosforilazione del residuo

di treonina in posizione 17 (T17) di MLC1, che potrebbe quindi rappresentare il

bersaglio della CaMKII, la cui attività è sotto lo stretto controllo dei livelli citoplasmatici del Ca2+. Questi dati ci hanno portato a formulare la seguente

IPOTESI DI LAVORO

MLC1, come risultato della fosforilazione dipendente dalla CaMKII, la cui attività è

regolata dalla via Ca2+/CaM, aumenta l’attività della ICl,swell indotta dallo stimolo ipotonico, conferendo Ca2+ sensibilità al canale VRAC.

Per verificare questa ipotesi, abbiamo condotto esperimenti elettrofisiologici su celluledi glioblastoma U251, che esprimono livelli endogeni di MLC1 molto bassi o addirittura assenti. Le cellule U251 utilizzate sono stateingegnerizzate in modo da

overesprimerela proteina MLC1 normale (wild-type, WT) o la proteina MLC1 con

una delle seguenti mutazioni sulla treonina in posizione 17 (un sito bersaglio di fosforilazione da parte della CaMKII): i) T17D, in cui al posto della treonina veniva

espresso l’aspartato; ii) T17A, in cui al posto della treonina veniva espressa l’alanina. La proteina MLC1-T17D rappresenta quindi il controllo positivo, in quanto la

presenza dell’aspartato che emula il fosfato inorganico grazie alla presenza di una

carica netta negativa, rende la proteina costitutivamente attiva. Contrariamente, la

proteina MLC1-T17A, grazie alla presenza dell’alanina al posto della treonina, impedisce la fosforilazione di MLC1 mediata da CaMKII, rendendo la proteina inattivabile. Come controllo interno, abbiamo usato cellule U251 trasfettate con un vettore vuoto (Scrambled, Scr, virtualmente senza MLC1).

MATERIALI E METODI

Generazione delle linee cellulari U251-MLC1. Per la generazione delle linee cellulari di astrocitoma U251 che esprimono stabilmente MLC1 WT o una delle forme

mutate di MLC1 nel sito di fosforilazione per la CaMKII in posizione 17, (T17A o

T17D), sono stati utilizzati costrutti retro virali come descritti in Lanciotti et al., 2012.

Le cellule U251 infettate con il virus contenente il vettore vuoto (scrambled, Scr),

sono state utilizzate come controllo interno.

Colture cellulari: Le linee cellulari di glioblastoma multiforme U251 trasfettate (codice ICLC: HTL99014) sono state selezionate e ottenute coltivando le cellule trasfettate in un terreno di coltura minimo essenziale (MEM) implementato con siero fetale bovino (FBS) al 10% inattivato al calore (Invitrogen, S. Giuliano Milanese,

Italia), 100 IU/ml di penicillina G, 100 µg/ml streptomicina e piruvato di sodio 1 mM e

contenente l’antibiotico G418 (gentamicina, Euroclone, Ltd, UK). Le fiasche di coltura sono state incubate a 37°C in atmosfera umidificata di CO2al 5%. Il terreno veniva cambiato due volte a settimana e le cellule venivano passate in una nuova fiasca quando confluenti. Per gli esperimenti elettrofisiologici, le cellule sono state

piastrate su piastre Petri a circa 30.000 cellule/ml e utilizzate 3 giorni dopo la semina.

Elettrofisiologia. Gli esperimenti di elettrofisiologia sono stati eseguiti utilizzando

la tecnica del patch clamp in configurazione “whole-cell” dializzato, per valutare le

correnti macroscopiche. Le correnti sono state amplificate con un amplificatore

HEKA EPC-10, digitalizzate con un convertitore di 12 bit A/D e analizzate con Patch-Master (versione 2 × 60, ELEKTRONIK) e Micro-cal Origin 6.0. La soluzione extracellulare standard (contenente 2mM Ca2+) conteneva: NaCl 140 mM, KCl 5 mM,

CaCl2 2 mM, MgCl2 2 mM, MOPS 5 mM, glucose 10 mM, (pH 7.40). La soluzione

extracellulare priva di Ca2+ conteneva: NaCl 140 mM, KCl 5 mM, MgCl2 4 mM,

MOPS 5 mM, glucose 10 mM, (pH 7.40). La soluzione interna conteneva: KCl 155

mM, EGTA-K 1 mM, MOPS 5 mM, MgCl2 1 mM (pH 7.20). La resistenza d’accesso,

che andava 8 and 15 MΩ, veniva raggiunta in seguito alla formazione del sigillo tra

la micropipette riempita della soluzione interna e contenente l’elettrodo interno di registrazione e la membrana plasmatica della cellula, attraverso rimozione del pezzetto di membrana incluso nel sigillo e veniva compensata attivamente al 50%. La soluzione ipotonica al 30%, necessaria per attivare e studiare la ICl,swell, veniva generata attraverso l’aggiunta di acqua distillata alla soluzione esterna, utilizzando le

corrette proporzioni. Per rimuovere il contributo delle correnti K+, alla soluzione

esterna veniva aggiunto cloruro di tetraetilammonio (TEA) 3 mM, un bloccante delle

correnti K+, e in particolare di quelle Ca2+-attivate di larga conduttanza (BK), altamente espresse nelle cellule U251. Le correnti ICl,swell venivano misurate a valori di

voltaggio pari a -80 mV, corrispondente al valore del potenziale di equilibrio del K+

(EK). Il dimetilsolfossido (DMSO) e il DCPIB sono stati acquistati dalla ditta Tocris

Bioscience. Il DCPIB è stato sciolto in DMSO alla concentrazione stock di 10 mM e

utilizzato alla concentrazione finale di 10 µM; La più alta concentrazione di DMSO

nelle soluzioni di registrazione è stata dello 0.1%.KN-93, inibitore della CaMKII, veniva usato alla concentrazione di 10 µM per verificare la via attraverso cuiMLC1

modula la ICl,swell.Tutti i reagenti venivano sciolti giornalmente alle concentrazioni

indicate e le soluzioni di registrazione venivano applicate nel piattino di coltura attraverso un sistema di perfusione a gravità. Gli esperimenti sono stati condotti a

temperatura ambiente (18-22°C).

RISULTATI

L’aumento della ICl,swell indotto da MLC1 nelle cellule U251, richiede la fosforilazione da parte della CaMKII. Per prima cosa abbiamo valutato la densità di corrente della corrente Cl- nei vari modelli cellulari (cellule Scr, WT, T17D e T17A) eseguendo esperimenti in configurazione whole-cell dializzato, utilizzando rampe da

-100 a +100 mV, da un potenziale di holding di -40 mV. La corrente Cl- è stata attivata perfondendo le cellule con una soluzione ipotonica extracellulare al 30% (Hyp

30%). Per eliminare il contributo delle correnti K+ attivate dal Ca2+ di larga conduttanza (canali BK), abbiamo aggiunto nella soluzione extracellulare TEA 3 mM. Inoltre la corrente è stata misurata al valore di potenziale di -80 mV, che rappresenta il

valore del potenziale di equilibrio per lo ione K+. Questo ulteriore accorgimento sperimentale garantiva l’esclusione totale del contributo di correnti K+ nelle nostre registrazioni. I risultati di questi esperimenti mostrano che, in seguito ad esposizione alla soluzione ipotonica, si osservava un significativo aumento di una corrente in

tutti e quattro i gruppi cellulari, che presentava caratteristiche biofisiche, cinetiche e

farmacologiche della ICl,swell. Infatti, come è possibile apprezzare dal time course in

Fig. 5A, la corrente entrante misurata a -80 mV attivata dallo stimolo ipotonico era

completamente bloccata da DCPIB 10 µM; inoltre, come mostrato nelle rampe rappresentative nell’inset del pannello A, la corrente attivata dallo stimolo ipotonico,

mostrava una tipica rettificazione esterna e un potenziale di inversione molto vicino

al valore del potenziale di equilibrio del Cl-, calcolato secondo l’equazione di Nernst

e aggiustato per la riduzione della concentrazione degli ioni dell’ordine del 30%. Infine, la corrente attivata dall’ipotonicità mostrava un’inattivazione tempo e voltaggio

dipendente, come indicato dalla famiglia di tracce di corrente ottenute applicando

step di voltaggio dell’inset di destra del pannello A. L’analisi quantitativa della densità di corrente attivata dall’ipotonicità e sensibile al DCPIB, dimostra che la corrente

è significativamente più alta nelle cellule U251 che esprimono la MLC1 WT (~54

pA/pF) rispetto alle cellule in cui MLC1 è assente (Src) (~32 pA/pF). Questo dato

indica che la proteina MLC1 aumenta la ICl,swell come precedentemente riportato

negli astrociti (Ref). Un dato molto interessante ottenuto in questa prima parte della

sperimentazione riguarda il fatto che le cellule T17D, in cui MLC1 è costitutivamente attivo, hanno mostrato un aumento della densità di corrente simile alle cellule

WT (~56 pA/pF), mentre la densità di corrente osservata nelle cellule T17A (~32 pA/pF), contenenti un MLC1 che non può essere fosforilata e attivata, era simile a

Scr che praticamente non aveva MLC1.

Questi risultati suggerirebbero che MLC1 debba essere fosforilata e attivata dalla

CaMKII per poter modulare la ICl,swell. A sostegno di questa visione, abbiamo mostrato che 10 µM KN-93, inibitore della CaMKII,acutamente aggiunto alla soluzione

ipotonica, era in grado di ridurre ICl,swell di ~50% nelle cellule WT (Figura 5C), in particolare, circa lo stesso rapporto di densità di corrente trovato tra WT vs Src o tra

T17D e T17A.

Figura 5. Registrazione elettrofisiologica della ICl,swell in cellule U251. A) Time course rappresentativo della densita di corrente (pA/pF) della ICl,swellmisurata da rampe di corrente a valori di voltaggio di -80 mV, il potenziale di inversione dello ione K+ nelle condizioni sperimentlai utilizzate,

durante l"applicazione di una soluzione ipotonica al 30% (barra grigia) e in seguito ad aggiunta di

10 µM DCPIB (barra verde). Inserti: Sinistra,rappresentative rampe di corrente da -100 a 100 mV

(durata 600 ms) ottenute da un potenziale di holding di -40 mV, in seguito ad esposizione ad una

soluzione ipotonica al 30% (traccia grigia) e una soluzione ipotonica al 30% contenente 10 µM

DCPIB (traccia verde); Destra, famiglie di tracce di corrente evocate applicando step di voltaggio di

1 s di durata da -100 a 120 mV, con incremento di 20 mV ogni step, da un potenziale di mantenimento di -40 mV in presenza di una soluzione ipotonica al 30% (tracce grigie), e in presenza di

una soluzione ipotonica contenente 10 µM DCPIB (tracce verdi).B) Grafico a barre che mostra la

densità di corrente media misurata a -80 mV, durante l'esposizione a una soluzione ipotonica al

30%, in cellule U251 trasfettate con vettore vuoto (Scr, n=10) e cellule U251 che esprimono una

proteina MLC1 wild type (WT, n= 14) o due diverse proteine MLC1 con mutazioni puntiformi che

sostituiscono una treonina in posizione 17 con un aspartato (T17D, n=9) o un'alanina (T17A,

n=14). C) Grafico a barre che mostra la media della ICl,swell frazionaria in presenza di 10 µM KN-93

(n=3). I dati sono mostrati come media #!SEM; *p<0.05; **p<0.01.

Ruolo dell’ingresso del Ca2+ extracellulare nell’aumento CaMKII/MLC1-dependentedella ICl,swell. Precedenti studi hanno dimostrato che: i) la CaMKII è attivata

dalla calmodulina in seguito ad aumento del Ca2+ citosolico; ii) l’aumento del Ca2+ citosolico potenzia l’attività della ICl,swell. Questi risultati identificano il Ca2+ come un

attore chiave nelle vie di attivazione sia di MLC1 che della ICl,swell. Questo ci ha portato a chiederci se l'entrata delCa2+extracellularefosse importante per l’attivazione

di MLC1. Per testare questa ipotesi, abbiamo eseguito esperimenti di elettrofisiologia in cui misuravamo la ICl,swell in assenza e in presenza di Ca2+ esterno. In questo

tipo di esperimenti, le cellule venivano perfuse per un periodo di 2-5 min con una

soluzione isotonicanon contenente Ca2+, di modo che tutto il Ca2+ extracellulare venisse rimosso. Successivamente, le cellule venivano prima perfuse con una soluzione ipotonica priva di Ca2+, per valutare la massima attivazione della ICl,swell in assenza di Ca2+ esterno, per poi essere perfuse con una soluzione ipotonica contenente Ca2+, per valutare l'eventuale ulteriore attivazione della corrente dovuta all’afflusso di Ca2+ esterno. Infine, sempre per dimostrare che la corrente attivata fosse una ICl,swell mediata dal canale VRAC, si aggiungeva alla soluzione ipotonica DCPIB

10 µM. La Figura 2A illustra un tipico esperimento condotto in cellule WT, che mostra l’attivazione della ICl,swell indotta da stimolo ipotonico in assenza di Ca2+ esterno e il suo ulteriore incremento in seguito ad aggiunta di Ca2+(Figura 6A). Come illustrato in Figura 6B, irisultati di questi esperimenti mostrano che la ICl,swell veniva

attivata in tutte le cellule in assenza di Ca2+ esterno, ma solo nelle cellule WT vi era

un ulteriore aumento della corrente in seguito all’aggiunta di Ca2+ esterno, mentre

in tutti gli altri tipi cellulari la densità di corrente rimaneva pressochè invariata.

Figura 6. Registrazione della ICl,swell in presenza e in assenza del Ca2+ extracellulare. A) Time

course rappresentativo - della ICl,swell in seguito ad applicazione di una soluzione ipotonica al 30%

non contenente Ca2+ (barra arancione, Hyp 30% 0 Ca) e di una soluzione ipotonica al 30% contenente 2 mM Ca2+ (barra grigia, Hyp 30%). B) Grafico a barre che mostra la media della ICl,swell frazionaria provocata dalla Hyp 30%, come normalizzato sulla corrente attivata da Hyp 30% 0 Ca2+

(linea tratteggiata), in cellule U251Scr (n=7), WT (n=7), T17D (n=7), and T17A (n=7). C) Grafico a

barre della media della densità di corrente durante esposizione alla soluzione ipotonica, in presenza (barra grigia) o assenza (barra verde) di Ca2+ extracellulare, valutata nelle cellule WT. I dati

sono mostrati come media ± SEM; **p<0.01.

In un altro set di esperimenti abbiamo valutato, in due gruppi separati di cellule WT,

la densità di corrente attivata da soluzione ipotonica in presenza o assenza di Ca2+

esterno in cellule (Fig. 6C). I risultati di questi esperimenti confermano che la ICl,swell

attivata dallo stimolo ipotonico in presenza del Ca2+ esterno(~54 pA/pF), era di circa il 70% più alta di quella attivata dalla soluzione ipotonica in assenza di Ca2+

esterno(~32 pA/pF) (Figure 6C). Nel loro complesso, i risultati ottenuti suggeriscono

che la ICl,swell può essere modulata in seguito ad ingresso delCa2+extracellulare, ma

solo dove l’attività della MLC1 può essere modulata per fosforilazione operata dalla

CaMKII. Questa è l’unica caratteristica principale che differenzia le cellule WT da

tutti gli altri modelli cellulari dove: i) MLC1 è virtualmente assente (Scr); ii) è virtualmente sempre fosforilato (T17D); iii) non può mai essere fosforilato dalla CaMKII (T17A).

Il potenziamento della ICl,swell dipendente dalla via CaMKII/MLC1 richiede un

rilascio di Ca2+ dagli store intracellulari indotto dall'afflusso di Ca2+ esterno.

Attraverso l’utilizzo di specifici fluorofori in grado di legarsi agli ioni Ca2+, numerosi

studi hanno dimostrato lo swelling cellulare indotto dall'ipotonicità è in grado di innescare il rilascio di Ca2+ dagli store intracellulari, come il reticolo endoplasmatico

(Refs). Questa osservazione ci ha portato a chiederci se questo rilascio si verificava nel nostro modello cellulare e, in secondo luogo, se la quantità di Ca2+ eventualmente rilasciata dal reticolo endoplasmatico fosse sufficiente per innescare

l'aumento della ICl,swell dipendente dall’attività di fosforilazione della CaMKII.

Per rispondere a questa domanda, abbiamo effettuato un esperimento in cuile cellule WT venivano pretrattate o meno con 1 µM tapsigargina (TG), un potente e irreversibile inibitore della sarco/endoplasmic Ca2+ ATPase (SERCA), il principale trasportatore di Ca2+posto nella membrana del reticolo endoplasmatico la cui funzione

è quella di riportare attivamente il Ca2+ dal citoplasma della cellula all’interno del lume. Quindi, incubando le cellule con TG in soluzione 0 Ca2+ per un periodo di almeno 5 minuti prima del protocollo sperimentale assicurava il completo svuotamento del reticolo.

Figure 7. Misurazione della ICl,swell in presenza e assenza di deplezione di Ca2+ degli store

intracellulari indotta dalla tapsigargina. A) Time course rappresentativo della ICl,swell durante applicazione di una soluzione ipotonica al 30% priva di Ca2+, seguita da una soluzione ipotonica contenente 2 mM Ca2+, in cellule WT il cui reticolo endoplasmatico è stato depleto di Ca2+ in seguito a

pretrattamento con 1 µM tapsigargina (TG). B) Grafico a barre riportante la densità di corrente media durante esposizione a una soluzione ipotonica priva di Ca2+, in cellule WT in assenza (CTRL) e

presenza (TG) di pretrattamento con TG, misurata a -80 mV. C) Grafico a barre che mostra la media della ICl,swell frazionaria stimolata da soluzione ipotonica, normalizzata alla corrente attivata dalla soluzione ipotonica 0 Ca2+, in cellule WT pretrattate o meno con TG. I dati sono mostrati come

media ± SEM; **p<0.01

Un esperimento rappresentativo condotto in cellule WT pretrattate con TG, dove la

soluzione ipotonica con 0 Ca2+ attiva una corrente entrante è mostrato nel pannello

A. Lo stesso protocollo sperimentale è stato applicato su cellule WT non pretrattate

con TG, utilizzate quindi come cellule controllo. I dati quantitativi, presentati nel

pannello B, mostrano che la ICl,swell misurata nelle cellule pretrattate con TG era inferiore di circa il 15% rispetto a quella delle cellule controllo, sebbene la differenza

tra i due gruppi non sia statisticamente significativa.

Poiché l'ingresso di Ca2+ dallo spazio extracellulare è in grado di attivare la ICl,swell

nelle cellule WT(Fig. 6), ci siamo quindi chiesti se il Ca2+ che entra nella cellula fosse in grado di potenziare la corrente direttamente, tramite la via della CaMKII/

MLC1,o indirettamente, attraverso l’induzione di un ulteriore rilascio di Ca2+ dal reticolo endoplasmatico, un processo noto come rilascio di Ca2+ indotto da Ca2+ (CICR).

Per capire se il CICR fosse importante per il potenziamento della ICl,swell dipendente

dalla via CaMKII/MLC1 abbiamo valutato la densità di corrente della ICl,swell attivata

dalla soluzione ipotonica con 0 Ca2+, in cellule WT pretrattate o non con TG e verificato la possibilità di osservare un ulteriore aumento della corrente in seguito ad

esposizione alla soluzione ipotonica contenente il Ca2+ (Fig. 7C), seguendo lo stesso procedimento logico utilizzato in Fig. 6. L’analisi quantitativa ha dimostrato che il

potenziamento della ICl,swell indotto dall’ingresso di Ca2+ esterno avveniva solo nelle

cellule non pretrattate con TG, mentre nelle cellule in cui il reticolo endoplasmatico

era svuotato di Ca2+, la ICl,swell rimaneva invariata (Figura 7C).

Nel complesso, i nostri risultati indicherebbero che né l’ingresso di Ca2+ dall’esterno

né il rilascio di Ca2+ dal reticolo endoplasmatico, da soli, sono in grado di modulare

la ICl,swell il cui potenziamento richiederebbe invece un’attività concertata delle due

fonti di Ca2+ attraverso il meccanismo CICR.

DISCUSSIONE

Quello che abbiamo valutato durante il periodo di tesi sperimentale è che la proteina MLC1 upregola la corrente cloro volume attivato (VRAC) conferendogli una calcio dipendenza. VRAC è importantissimo per la regolazione dello swelling cellulare, il quale è uno stress per la cellula. Durante gli esperimenti rispetto all’astrocitoma

vuoto, quando si esprimeva la MLC WT, si osserva quasi un 50% di upregolazione

della corrente cloro. Oltre alle cellule WT e scrumble, vi sono anche le cellule mutate nel sito di fosforilazione chiamate T17A e T17D. In prima istanza abbiamo dimostrato che la MLC upregola la corrente cloro e questa upregolazione è dipendente dalla fosforilazione della MLC nel sito 17. Per confermare l’ipotesi che la fosforilazione del sito 17 è importante grazie alla CamKII, abbiamo utilizzato un inibitore

chiamato KN93. Abbiamo stimolato VRAC con una soluzione ipotonica, poi mantenendo l’ipotonica si aggiungeva il KN93. E’ stato osservato che veniva bloccata

metà della corrente nelle cellule WT. Se una CaMKII è coinvolta quello che succede

è che questo fenomeno di upregolazione dipenderà dal calcio. Proseguendo gli

esperimenti siamo andati a studiare la calcio dipendenza, in particolare modo il

coinvolgimento del calcio dagli store intracellulari o dall’esterno. Come primo step

siamo andati a testare la tapsigargina, dove la curva di attivazione è stata ottenuta

sempre con l’ipotonica e con zero calcio extracellulare. L’esperimento veniva condotto con zero calcio, ma poteva essere presente o meno la tapsigargina (TG). In

questo modo vediamo se c’è un rilascio di calcio dagli store indotto dall’ipotonicità.

Capito di per sé che lo store non contribuisce siamo andati a capire se ci fosse o

meno un afflusso di calcio. Abbiamo tenuto la cellula in zero calcio e poi abbiamo

stimolato con una soluzione ipotonica. Dopo la stimolazione si aggiungeva il calcio

extracellulare. Quello che abbiamo visto è che si attiva la corrente nelle cellule WT

di circa un 30%, mentre nel resto delle cellule non vi era nessun effetto, quindi l’effetto del calcio è importante perché in sua presenza o assenza si verificava o meno

il fenomeno. Possiamo infine concludere che sulle cellule che esprimono la proteina MLC ci sono i canali TRPV4, upregolati dalla MLC, i quali fanno entrare il calcio

in risposta all’ipotonicità. L’ipotonicità attiva i canali, il calcio riesce ad entrare, ma

essendo poco il calcio che entra, c’è bisogno che venga indotto l’attivazione della

rayanodina, coinvolta nel Ca2+ induce-calcium release, ovvero faranno fuoriuscire

più calcio per poter andare sulla CaMKII e fosforilare MLC. Una volta che la MLC è fosforilata c’è l’upregolazione di VRAC. Collettivamente, i risultati che si sono ottenuti durante questo periodo di tesi sperimentale, hanno fornito nuove conoscenze

in merito a diversi quesiti tutt’oggi irrisolti, in diversi campi di studio. Per prima cosa

abbiamo dato un contributo essenziale nell’ormai storico dibattito, ancora del tutto

non chiaro, circa la modulazione del canale VRAC (e di conseguenza della corrente

ICl,swell) da parte del Ca2+ citosolico. I nostri dati possono infatti dimostrare che il

canale VRAC, che di per se probabilmente non presenta una Ca2+ dipendenza,

acquista sensibilità al Ca2+ solo in seguito a modulazione da parte di altre proteine

Ca2+-attivate, tra cui MLC1. Questo discorso ha un respiro più ampio, alimentando

l’idea che la modulazione della ICl,swell da parte del Ca2+ potrebbe esclusivamente

dipendere dall’espressione di specifiche proteine in specifici tipi cellulari, da cui

l’apparente incongruenza dei dati sperimentali ottenuti nel corso dei decenni dai

vari laboratori di ricerca.

CONCLUSIONI

Complessivamente, i nostri risultati ci hanno portato a dedurre che l’aumento della

ICl,swell richiede: i) l’ingresso di Ca2+ extracellulare, probabilmente attraverso i canali

TRPV4 che sono stati dimostrati essere oinvolti nel mediare l’ingresso di Ca2+ in

seguito a stimolo ipotonico, nello stesso modello cellulare utilizzato in questo studio; ii) l'attivazione del meccanismo CICR; iii) l'attivazione della via CaMKII/MLC1

che termina con la fosforilazione di MLC1 (ammesso che MLC1 sia presente e

possa essere attivato).

I possibili meccanismi molecolari attraverso i quali MLC1 modula la ICl,swell mediata

dal canale VRAC, conferendole sensibilità al Ca2+, sono sintetizzati nel modello in

Fig. 8.

Figura 8. Modello schematico che propone i meccanismi molecolari attraverso cui la proteina MLC1 conferisce sensibilità al Ca2+ alla ICl,swell mediata dal canale VRAC.L'esposizione a

uno stress ipotonico induce il rigonfiamento cellulare che a sua volta innesca l'apertura di entrambi

i canali VRAC e TRPV4. L'ingresso di Ca2+ extracellulare attraverso il canale TRPV4 promuove il

rilascio di Ca2+ dal reticolo endoplasmatico (ER), probabilmente mediato dal canale del recettore

rianoduno (RyR),attraverso il meccanismo CICR. Il conseguente aumento del Ca2+ intracellulare è

rilevato dalla calmodulina (CaM), proteina legante il Ca2+, che si lega e attiva la proteina chinasi II

Ca2+/calmodulina-dipendente (CaMKII). CaMKII promuove l'attivazione di MLC1 fosforilando una

treonina in posizione 17 (T17). L'MLC1 attivato migliorerebbe quindi l'attività dei canali VRAC.

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